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Check list analyse de données RNA-seq O. tauri avec Unix
Pierre Poulain
Creative Commons Attribution-ShareAlike (CC BY-SA 4.0)

Analyse de données RNA-seq avec Unix : check list

Étape 1 : préparation de l'environnement de travail

Chargement de l'environnement conda

  • Conda est disponible dans mon shell.
    La commande conda --version ne renvoie pas de message d'erreur.
    La version de conda est : ___________________________
  • L'environnement conda pour l'analyse RNA-seq est activé.
    Mon invite de commande ressemble à quelque chose du type : 
    (rnaseq) ppoulain@candihub:~$

Vérification des logiciels disponibles

  • La version de fastqc est : ___________________________
  • La version de bowtie2 est : ___________________________
  • La version de samtools est : ___________________________
  • La version de htseq-count est : ___________________________

Étape 2 : préparation des données

  • Le répertoire RNAseq est créé dans mon répertoire personnel.
  • Les fichiers contenant les reads (.fastq.gz) sont copiés dans le répertoire RNAseq.
    Identifiants des échantillons (le XX de 140317_SN365_A_L001_HCA-XX_R1.fastq.gz)
    ._______ _______ _______ _______
  • Le fichier contenant la séquence du génome de référence (.fna) est copié dans le répertoire RNAseq.
  • Le fichier contenant les annotations du génome de référence (.gff) est copié dans le répertoire RNAseq.
  • Les fichiers contenant les reads (.fastq.gz) ont été renommés correctement sur la forme HCA-XX_R1.fastq.gz, avec XX le numéro de l'échantillon.
  • Volume total des données copiées : ___________

Étape 3 : analyse manuelle

Identifiant de l'échantillon contenant les reads que vous allez analyser : ___

Contrôle qualité

  • Lancement de FastQC.
  • Copie du fichier .html généré par FastQC sur ma machine (via FileZilla ou scp).
  • Visualisation de l'analyse.

Indexation du génome de référence

  • Lancement de Bowtie (commande bowtie2-build).
  • Taille occupée par les fichiers d'index crées par Bowtie : ______

Alignements des reads sur le génome de référence

  • Lancement de Bowtie (commande bowtie2).
    Nombre total de reads dans le fichier .fastq.gz : ____________
    Nombre de reads non alignés : ____________
    Nombre de reads alignés (au moins 1 fois) : ____________
    Taux d'alignement : ____________
  • Taille du fichier d'alignement créé par Bowtie : ___________

Pourquoi le fichier d'alignement créé par Bowtie est beaucoup plus gros que le fichier contenant les reads ?
.______________________________________________________________ .______________________________________________________________ .______________________________________________________________

Conversion des reads alignés en binaire, tri et indexation

  • Lancement de SAMtools pour convertir le fichier d'alignement des reads en binaire.
    Taille du fichier créé par SAMtools : _______________
  • Lancement de samtools pour trier les reads alignés.
    Taille du fichier créé par SAMtools : _______________
  • Lancement de samtools pour indexer les reads alignés.
    Nom du fichier d'index : ___________________________________

Visualisation des reads alignés avec IGV

Les fichiers suivants sont copiés sur la machine locale :

  • génome de référence (.fna)
  • annotations du génome de référence (_DUO2.gff)
  • bam trié (bowtie.sorted.bam)
  • index du bam trié (bowtie.sorted.bam.bai)

IGV :

  • Lancement d'IGV et chargement des différents fichiers
  • Visualisation du gène ostta18g01980 dans IGV.

Comptage des reads alignés sur les gènes de O. tauri

  • Lancement de HTSeq
    Nombre d'annotations contenues dans le fichier .gff : _______________
  • Recherche du gène ostta18g01980 dans le fichier de comptage.
    Nombre de reads alignés sur ce gène : _______________

Bravo !

Étape 4 : automatisation de l'analyse : niveau 1

  • Ouverture du script 1
  • Les trois variables dans ce script sont : ._______________ _______________ _______________
  • Téléchargement du script 1
  • Modification de la variable qui contient le numéro d'échantillon
  • Lancement du script 1
  • Café ! ☕ 🍪 ☕ 🍪

Étape 5 : automatisation de l'analyse : niveau 2

  • Une évolution possible du premier script : ._____________________________________________
  • Téléchargement du script 2
  • Modification du script 2 pour mon échantillon.
  • Lancement du script 2.

Étape 6 : Automatisation de l'analyse : niveau 3 (ninja)

  • Activité et exercices boucle de Software Carpentry
  • Téléchargement du script 3
  • La variable à modifier avec mes numéros d'échantillon est : ._________________
  • Lancement du script 3.