RNA-seq 数据分析流程

本项目提供了一个基于 Python 实现的 RNA-seq 数据分析流程，涵盖从原始数据的质量控制到差异表达分析的所有关键步骤。该流程集成了多个主流的生物信息学工具，如 FastQC、Trim Galore、Hisat2 和 FeatureCounts，并使用 R 语言中的 DESeq2 进行差异表达分析。

目录

• 环境要求
• 工具安装
• Python 库安装
• 项目结构
• 使用方法
• 文件说明
• 结果展示
• 参考文献

环境要求

要在本项目中运行 RNA-seq 数据分析流程，请确保在系统上满足以下要求：

• 操作系统：Linux 或 macOS（Windows 用户建议使用 Windows 子系统 Linux (WSL)）
• Python 版本：3.6 或更高
• R 版本：3.5 或更高（用于差异表达分析所需的 DESeq2）
• 硬件要求：充足的存储和内存资源，以处理较大规模的 RNA-seq 数据集

工具安装

请确保安装以下生物信息学工具，所有命令应通过命令行执行：

1. FastQC：用于评估原始 RNA-seq 数据的质量。

   sudo apt-get install fastqc

2. Trim Galore：用于去除低质量碱基和接头序列。

   sudo apt-get install trim-galore

3. Hisat2：用于将 RNA-seq 读段高效比对到参考基因组。

   sudo apt-get install hisat2

4. FeatureCounts（Subread 包的一部分）：用于从比对结果生成基因表达计数。

   sudo apt-get install subread

5. DESeq2（R 包）：用于差异基因表达分析。 在 R 控制台中运行以下命令安装 DESeq2：

   install.packages("BiocManager")
   BiocManager::install("DESeq2")

Python 库安装

本项目依赖几个 Python 库。可以通过以下命令安装这些库：

pip install pandas matplotlib seaborn rpy2

• pandas：用于处理表格数据（如基因计数矩阵）。
• matplotlib & seaborn：用于生成图表和可视化结果。
• rpy2：用于在 Python 环境下调用 R 语言功能，包括 DESeq2。

项目结构

该项目的目录结构如下所示：

.
├── data/
│   ├── fastq/                # 存放原始 FASTQ 数据
├── genome/
│   ├── hisat2_index/         # 存放 Hisat2 索引文件
│   ├── annotations.gtf       # 基因组注释文件（GTF 格式）
├── results/                  # 存储分析输出结果
│   ├── fastqc/               # FastQC 质量控制结果
│   ├── trimmed/              # 修剪后的 FASTQ 文件
│   ├── hisat2/               # 比对结果（SAM/BAM 文件）
│   ├── counts.txt            # FeatureCounts 生成的计数矩阵
│   ├── deseq2_results.csv    # 差异表达分析结果
│   ├── significant_genes.csv # 显著差异基因结果
│   ├── volcano_plot.png      # 差异表达基因的火山图
├── conditions.csv            # 样本条件文件，定义差异表达分析中的实验组别
├── rnaseq_analysis.py        # 实现 RNA-seq 全流程分析的 Python 脚本
└── README.md                 # 项目说明文档（即本文件）

-以上为规划，还未完全完成项目

使用方法

1. 准备数据：

• 将 RNA-seq 的原始 FASTQ 文件放置在 ./data/fastq/ 目录下。
• 将 Hisat2 的参考基因组索引文件放置在 ./genome/hisat2_index/ 目录下。
• 确保基因组注释文件（annotations.gtf）位于 ./genome/ 目录中。

2. 定义样本条件：

在项目根目录下创建文件 conditions.csv，用于定义各个样本对应的实验条件。文件格式如下：

sample,condition
sample1,treatment
sample2,control
sample3,treatment
sample4,control

• sample：样本名称，需与 FASTQ 文件名对应。
• condition：样本所属的实验条件（如处理组或对照组）。

3. 执行 RNA-seq 分析脚本：

通过命令行在项目根目录下运行以下命令

python rnaseq_analysis.py

该脚本将依次执行以下步骤：

• 数据质量评估：使用 FastQC 对原始数据进行初步质量控制。
• 数据修剪：使用 Trim Galore 去除接头和低质量序列。
• 比对到参考基因组：使用 Hisat2 将修剪后的读段比对到参考基因组。
• 读段计数：使用 FeatureCounts 生成每个基因的表达计数矩阵。
• 差异表达分析：使用 DESeq2 进行差异基因表达分析。
• 可视化：生成火山图，用于展示差异表达基因的显著性和倍数变化。

4. 查看结果：

所有分析结果将保存在 ./results/ 目录中。主要结果包括：

• 差异表达分析结果：deseq2_results.csv 文件包含差��基因表达分析的详细结果。
• 显著差异基因：significant_genes.csv 包含筛选出的显著差异基因。
• 火山图：volcano_plot.png 文件展示了差异表达基因的可视化结果。

文件说明

• rnaseq_analysis.py：主分析脚本，涵盖从数据质量控制到差异表达分析的整个流程。
• conditions.csv：定义样本与实验条件关系的文件，用于差异表达分析。
• counts.txt：由 FeatureCounts 生成的基因表达计数矩阵。
• deseq2_results.csv：DESeq2 生成的差异表达分析结果，包括基因的倍数变化、p 值和调整后的 p 值。
• significant_genes.csv：包含显著差异基因的结果文件。
• volcano_plot.png：火山图，展示差异表达基因的显著性与倍数变化。

结果展示

1. 火山图 (Volcano Plot)：

火山图展示了所有差异表达基因的显著性（p 值）与倍数变化（log2FoldChange）的关系。下图为火山图的示例：

2. DESeq2 分析结果：

DESeq2 生成的差异表达结果保存在 deseq2_results.csv 文件中，主要包括以下字段：

• log2FoldChange：基因表达的对数倍数变化，表示在实验条件间的差异表达。
• pvalue：差异表达的显著性 p 值。
• padj：使用 Benjamini-Hochberg 方法校正的 p 值，用于控制多重检验的假阳性率。

作者

• 姓名：Xiexuan
• 邮箱：xiexuan@njfu.edu.cn
• 单位：南京林业大学

参考文献

• FastQC：Andrews, S. (2010). FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data.
• Trim Galore：Krueger, F. (2012). Trim Galore: A Wrapper Tool Around Cutadapt and FastQC to Consistently Apply Quality and Adapter Trimming to FastQ Files.
• Hisat2：Kim, D., et al. (2015). HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods, 12(4), 357-360.
• FeatureCounts：Liao, Y., et al. (2014). featureCounts: an efficient general-purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics, 30(7), 923-930.
• DESeq2：Love, M.I., et al. (2014). Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology, 15(12), 550.